"In vitro" izotópdiagnosztika

Valamely anyag koncentrációjának mérése vérből, vizeletből vagy más preparátumból sugárzásmérésen alapuló eljárás segítségével, diagnosztikai célból. Ilyenkor a vizsgált egyed nem érintkezik radioaktív anyaggal, sugárterhelés nem éri.

Az első ide tartozó eljárás Yalow és Berson inzulin-meghatározásra kidolgozott radioimmunoassay-e volt 1960-ban. (A „peptide hormonok radioimmunoassay-einek kifejlesztéséért” Rosalyn Yalow 1977-ben orvosi Nobel-díjat kapott.)

"Ligand assay" módszerek

A bemutatandó izotópdiagnosztikai módszerek a (fajlagos) kötésen alapuló koncentráció-mérő eljárások, ún. ligand assay-k bővebb családjába tartoznak. Ezeket különböző szempontok szerint csoportosíthatjuk:

-        Csoportosítás a reakció típusa szerint

o       Yalow és Berson módszere az ún. telítési analízisek ("saturation analysis") családjába tartozik, amelynek lényege, hogy a mérendő anyag és annak (pl. radioizotóppal) jelzett változata között versengés folyik valamilyen (rögzített mennyiségű, specifikus) kötőhelyekért.

o       Másik (újabb) eljárás-családba tartoznak a nem kompetitív módszerek (pl. IRMA).

-        Csoportosítás az alkalmazott fajlagos kötőanyag szerint:

Módszer	Alkalmazott kötőhely	Kidolgozás
Immuno Assay	Immunglobulinok	1960, Yalow és Berson
Competitive Protein Binding Assay (CPBA)	Kötőfehérjék a szérumból	1960, Ekins
Receptor Assay	Sejtfal-receptorok

-        Csoportosítás a jelzés módja szerint:

o       Mindezek az eljárások kivitelezhetők radioaktív és

o       alternatív nyomjelzési eljárással.

Az alábbiakban a radioaktív jelzést alkalmazó koncentráció-mérő eljárások két legelterjedtebb fajtáját, a RIA-t és az IRMA-t mutatjuk be részletesebben. Röviden összehasonlítjuk őket egymással és az alternatív eljárásokkal.

Radioimmunoassay

Amennyiben a telítési analízis eljárásában radioaktív jelzést és kötőanyagként immunizálás útján kapott antitesteket alkalmazunk, az eljárást radioimmunoassay-nek (röviden: RIA) nevezzük.

A RIA lépései:

1. Három alapvető komponenst mérünk össze a reakció-elegybe:
1. a mérendő anyagot tartalmazó oldatot (leggyakrabban szérumot): L ("ligandum")
2. a mérendő anyag radioaktívan jelzett változatát: L*
3. és a mérendő anyag elleni antitestet: Ab ("antibody"):
   
2. Megvárjuk, amíg a kötési reakció egyensúlyi (vagy aközeli) állapotot ér el a tömeghatások törvényének megfelelően. Minél több a mérendő anyag (L) a reakcióelegyben, annál több LAb, és annál kevesebb L*Ab komplex keletkezik.
3. Különválasztjuk a kötött (L*Ab, az antitest miatt 100000 feletti mólsúlyú) és a kötetlen (L*, általában legfeljebb néhány ezres mólsúlyú) jelzett anyagot.
   (Ezzel természetesen a jelzetlen összetevők szétválasztása is megtörténik, de azok a következő sugárzásmérés eredményét nem befolyásolják.)
   A szétválasztás leggyakrabban használt módjai:
1. csapadékképzés enyhén alkoholos jellegű oldat (pl. polietilén-glikol, PEG) hozzáadásával és centrifugálással (a kötött frakció megy üledékbe)
2. a szabad frakció megkötése pl. aktív szén felületén, majd leülepítése
3. az első antitest ellen termeltetett második antitest hozzáadása, majd az így kapott több százezres mólsúlyú óriásmolekulák leülepítése.
4. Megmérjük vagy a kötött, vagy a szabad frakció sugárzását.
5. Meghatározzuk a mért beütésszám és a koncentráció közötti összefüggést a mérési sorozatba betett ismert koncentrációjú minták segítségével. A kapott kalibrációs görbe a kötött frakció mérése esetén szigorúan monoton csökkenő, a szabad frakció mérése esetén szigorúan monoton növekvő lesz.
6. A kalibrációs görbe segítségével minden egyes ismeretlen minta beütésszámához megkeressük a hozzá tartozó koncentrációt.
   (A két utóbbi lépést régebben milliméterpapír segítségével kézi módszerrel végezték, ma már általában számítógéppel történik.)

A RIA módszereket évtizedeken keresztül igen kiterjedten alkalmazták számos, a vérben nmol/l nagyságrendű koncentrációban jelen levő anyag mérésére. A módszer előnye egyszerűsége, és az, hogy ilyen alacsony koncentráció rutinszerű, nagy számú mintából történő mérésére abban az időben (az 1960-as években) más módszer nem állt rendelkezésre.

A specifikus antitestet általában nyúlban termeltetik néhány hónapig tartó ismételt immunizálásokkal. Mivel a kis molekulájú anyagok a vérből igen gyorsan kiválasztódnak a vesén keresztül, ezeket az immunizáláshoz valamilyen nagyobb molekulához szokták kötni, leggyakrabban humán vagy marha szérumalbuminhoz (HSA ill. BSA).

Immunoradiometric assay (IRMA)

A RIA-nál pontosabb, így (a nmol/l-nél) alacsonyabb koncentrációk mérését is lehetővé tevő eljárás-család az immunoradiometric assay (rövidítve: IRMA; Miles és Hales, 1968), mely nem versengéses módszer.

Az IRMA lépései:

1. Előzetesen a mérendő anyag ellen termeltetett specifikus antitestet valamilyen szilárd felületen (kémcső falán, üveg- vagy műanyag golyók felületén, mágnesezhető térhálós óriás polimeren, stb.) rögzítik.
2. Ehhez mérjük hozzá a mérendő anyagot tartalmazó (leggyakrabban szérum) mintát.
3. Bizonyos reakcióidő eltelte után az antitesthez nem kötődött anyagot ismételt öblítéssel lemossuk. (Pl. a csőhöz kötött antitest esetén mosóoldatot mérünk bele a kémcsőbe, örvénykeverővel megkeverjük, majd leöntjük.)
4. Ezután olyan másik, szintén a mérendő anyag (másik kötőhelye) ellen termelt antitestet mérünk a kémcsőbe, amely radioaktívan jelezve van. Ez a szilárd felületen az előző lépésekben megkötődött mérendő molekulákhoz kapcsolódik. Minél több volt a mérendő anyagból a mintában, annál több kötődött a szilárd felülethez (az első antitesten keresztül), tehát annál több jelzett második antitest tud kötésbe menni.
5. Egy idő eltelte után (a 3. lépéshez hasonlóan) a kötésbe nem ment jelzett antitestet mosással eltávolítjuk a kémcsőből.
6. Ezután megmérjük a kémcsövek radioaktivitását. Ebből a RIA-nál alkalmazott eljáráshoz hasonlóan, kalibrációs görbe segítségével számolhatjuk ki az egyes minták koncentrációját.

Az IRMA-t szemléletesen szendvics-eljárásnak is nevezik, mivel a mérendő anyag molekulájához két oldalról kötődik az első és a második (jelzett) antitest.

A RIA és az IRMA összehasonlítása:

Szempont	RIA	IRMA
Jelzett komponens	a mérendő molekula változata	második antitest
Versengés kötőhelyekért	van	nincs (az egyes kötési reakciók időben szétválasztottak!)
A kötési reakciók egyensúlyig mennek?	igen (vagy a közelébe)	nem szükséges
Szétválasztás	ülepítéssel	egyszerű lemosással
Mérhető koncentráció	kb. nmol/l	< nmol/l
Reprodukálhatóság (hiba)	kb. 10 %	néhány %

Összevetés nem radioizotópos eljárásokkal

Az utóbbi évtizedben több, a RIA-val és IRMA-val azonos koncentráció-tartományban mérő, nem radioaktív jelzést alkalmazó ("alternatív") eljárást fejlesztettek ki. Maga az eljárás elve a RIA-hoz vagy az IRMA-hoz hasonló, de a nyomjelzés enzimekkel, lumineszcens anyagokkal, illetve ezek kombinációjával történik.

Igen érzékeny mérés végezhető pl. olyan jelzőanyaggal, amely egy rövid idejű (villanás-szerű) megvilágítás után hosszan (~0.1 s) foszforeszkál. Ezt a foszforeszkálást mérik egy jellemző hullámhosszon akkor, amikor a nem specifikus fluoreszcencia már kialudt.

A radioizotópos és alternatív eljárások összehasonlításakor széles körben elterjedt félreértés, hogy az alternatív eljárások általában pontosabbak lennének; valójában a pontosság elsősorban a reakció elvétől függ. Igy a "RIA-típusú" (versengéses) eljárások általában pontatlanabbak az "IRMA-típusúaknál", az utóbbiak pontossága viszont a kétféle jelzéssel kb. hasonló. Ennek megfelelően a metodika megválasztását egyéb szempontok döntik el.

Szempont	Radioizotópos eljárás	Alternatív eljárás
Eltarthatóság	6-8 hét	8-12 hó
Összeállítás lehetséges módja	kézi v. automata	automata
Kalibráció mérési sorozatonként	Teljes	részleges elég
Egy meghatározás ára		többszörös

Tehát akkor előnyös a radioizotópos metodika alkalmazása, ha a vizsgálati kérések nagy száma és gyakorisága a (kb. 40 mintás) mérési sorozatokba történő összegyűjtést lehetővé teszi. Ezzel szemben az alternatív eljárások alkalmazása célszerűbb a ritkább, de sürgős vizsgálatoknál. A két táborba tartozó módszerek fejlesztése párhuzamosan folyik ma is, és (az alternatív módszerek elterjedésekor megfogalmazott jóslatokkal szemben) az "in vitro" radioizotópos eljárások várhatóan a laboratóriumi diagnosztika szerves részét képezik az elkövetkező évtizedekben is.